近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、北大成都前沿交叉生物技术研究院王初课题组在J. Am. Chem. Soc.杂志上发表了题为“Cross-Species Profiling of Itaconate-Mediated Modifications by a Universal Probe”的论文。在这项工作中，作者发展了通用型衣康酸修饰化学探针，结合化学蛋白质组学技术，在哺乳动物细胞和细菌中实现了对衣康酸两种不同类型的翻译后修饰的鉴定，揭示了衣康酸通过共价修饰关键代谢蛋白调节其活性，并提出衣康酸生物合成的正反馈调控作用。
衣康酸是具有抗炎、抗菌活性的代谢物分子，它在病原菌侵染的炎症巨噬细胞中会大量产生，浓度可达到毫摩级别。衣康酸可以对蛋白形成两种不同类型的翻译后修饰。首先，由于衣康酸具有共轭不饱和双键结构，它可以通过迈克尔加成反应共价修饰蛋白的半胱氨酸残基，形成烷基化修饰并影响蛋白的生物学功能。为了实现大规模的衣康酸烷基化修饰鉴定，近年来王初课题组发展了多种定量化学蛋白质组学工具，实现了对宿主巨噬细胞以及细菌等多种体系的衣康酸烷基化的鉴定和功能研究，例如非天然糖探针1-OH-Az，以及衣康酸的生物正交类似物探针ITalk和C3A（号外 | 王初课题组和陈兴课题组合作开发半胱氨酸糖探针揭示衣康酸对糖酵解的负反馈调控，号外 | 王初课题组发展新型探针大规模分析炎症巨噬细胞中的衣康酸修饰，号外 | 王初课题组发展沙门氏菌中的衣康酸修饰组学鉴定新方法，号外｜王初课题组发现衣康酸抑制细菌生长新机制）。值得一提的是，上述两个类似物探针具有物种偏好性，其中ITalk主要应用于哺乳动物细胞，而C3A则应用于细菌。
另外，王初课题组此前还报道了衣康酸可以修饰到蛋白赖氨酸残基上，形成衣康酰化修饰，并且证明了细胞内的衣康酰辅酶A选择性地发生在C4位置的羧基上，暗示着衣康酰化修饰具有C4构型偏好（号外 | 王初课题组与董甦伟课题组合作发现巨噬细胞中的衣康酰化修饰）。针对衣康酰化修饰，王初课题组开发了直接捕获化学探针（号外 | 王初课题组开发基于硫醇探针的赖氨酸衣康酰化位点特异性分析方法）。
上述发展的化学探针极大地丰富了衣康酸修饰研究的化学工具箱，但仍然存在一定局限性。首先ITalk和C3A均是在C4位羧基衍生的炔基官能团，和形成衣康酰辅酶A的位置冲突，不能用于鉴定衣康酰化修饰。而BMAyne探针是基于硫醇的反应弹头，仅能针对衣康酰化修饰。也就是说，目前仍然缺乏可以同时鉴定两种衣康酸修饰的探针。针对这一问题，本工作基于现有的C4探针，尝试将炔基官能团换到C1位，这样便保留了形成酰基辅酶A的C4位羧基，有希望能同时鉴定两种不同的衣康酸修饰。作者发现C3A对应的C1异构体探针（C1-isomer C3A，后续简称isoC3A）在哺乳动物细胞的标记效果和ITalk类似，在细菌中的标记效果和C3A类似。通过化学蛋白质组学技术，作者发现isoC3A在巨噬细胞中可以鉴定到153个衣康酰化修饰位点。该酰化数据集包含了多个已知的修饰位点（例如H2B1B-K35, -K44, -K47, K109），以及潜在的新修饰位点，其中作者对PPIA的K125进行了位点验证。对于半胱氨酸烷基化修饰，isoC3A在巨噬细胞中鉴定到约2000个修饰位点，表现出和ITalk类似的效果，并且鉴定到许多潜在新位点。在沙门氏菌中，isoC3A和C3A的位点具有大于80%的重合度。
作者进一步发现isoC3A不仅能同时鉴定衣康酸烷基化修饰和衣康酰化修饰，还可以应用到真核与原核细胞体系中，具有物种普适性。在天然免疫研究中，LPS刺激巨噬细胞是常用的模型，而LPS主要通过TLR4发挥作用，但真实的细菌侵染过程还涉及更复杂的机制，例如沙门氏菌的T3SS分泌系统，也就是说LPS处理并不能完全模拟侵染过程。考虑到isoC3A的物种普适性，作者利用该探针对沙门氏菌侵染巨噬细胞过程的衣康酸修饰进行了定量，寻找宿主和病原菌对衣康酸修饰的敏感位点，这些组学数据可以帮助研究者们更深入地研究衣康酸修饰的生理功能并理解天然免疫的过程。
在活化的巨噬细胞中，衣康酸的生物合成依赖于顺乌头酸脱羧酶IRG1的大量表达，同时也需要细胞提供大量的IRG1底物顺乌头酸去合成衣康酸，三羧酸循环的关键蛋白顺乌头酸水合酶ACON是线粒体内顺乌头酸的主要来源。从催化过程来说，ACON通过催化底物柠檬酸/异柠檬酸脱水产生顺乌头酸中间体，然后顺乌头酸通过水合反应生成异柠檬酸/柠檬酸，完成异构化过程。有趣的是，作者通过isoC3A探针和化学蛋白质组学，发现衣康酸能够修饰到ACON结合铁硫簇的3个半胱氨酸（C385，C448和C451），而铁硫簇是ACON蛋白结合底物和催化的关键结构。作者通过体外生化实验，证明了衣康酸修饰能促进ACON脱水反应的活性，并抑制水合反应，从而促进线粒体的顺乌头酸累积。基于上述实验结果，作者提出了一个潜在的衣康酸生物合成途径的正反馈调节机制。
总之，本工作设计发展了新型衣康酸生物正交类似物探针isoC3A，并将其用于衣康酸介导的翻译后修饰位点鉴定中。isoC3A是普适性的衣康酸探针，可以在真核以及原核体系鉴定两种衣康酸介导的翻译后修饰，并能病原菌侵染体系中实现同时对宿主和病原菌的修饰位点的鉴定和定量分析。通过化学蛋白质组学分析，本工作发现衣康酸能修饰到巨噬细胞ACON蛋白的关键半胱氨酸上，并正反馈调节衣康酸的生物合成。这些研究结果丰富了衣康酸研究的工具箱，为理解衣康酸对天然免疫过程中的代谢调控作用及相关分子机制提供了新的工具和视角。
本文的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、北京大学成都前沿交叉生物技术研究院的王初教授以及北京大学成都前沿交叉生物技术研究院的肖伟弟副研究员。北京大学化学与分子工程学院2021级博士研究生马斌为本文第一作者，2019级毕业生刘东阳博士为本工作作出了重要贡献。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国家研究中心、教育部等项目的支持。
原文链接：
https://doi.org/10.1021/jacs.6c10764
