瞬时受体电位经典通道（TRPC）是一类受体调控的非选择性阳离子通道，可介导钠离子、钙离子等阳离子内流，引发细胞膜去极化并激活下游钙依赖性信号通路，在细胞信号传导过程中发挥关键生理功能1。人体内共存在6种TRPC亚型，其中TRPC3在小脑组织中高表达，对浦肯野细胞的正常发育与生理功能维持至关重要2。既往研究表明，TRPC3功能获得性突变T561A可造成小鼠浦肯野细胞树突分支异常、小脑共济失调，呈现特征性的“月行者（Moonwalker）”步态表型2。此外，TRPC3广泛参与免疫应答、肿瘤发生发展以及多种心血管与神经系统疾病进程，是极具潜力的新型药物靶点3。
TRPC3可被第二信使二酰甘油（DAG）直接激活1。以往结构研究已解析了TRPC3的整体三维结构4,5，鉴定了关键的钙离子结合位点（CBS）6，并阐明了内源性DAG、小分子激动剂GSK1702934A、4n等激动剂与通道的结合模式，为理解TRPC3的配体识别机制提供了重要分子基础7。尽管相关研究已取得系列进展，但该领域仍存在关键科学空白：目前已报道的所有TRPC3及其他TRPC家族成员结构均处于非导通的关闭构象，TRPC3由关闭态向开放态转变的门控机制尚不明确。
近日，北大-清华生命科学联合中心、北京大学未来技术学院陈雷研究员课题组在《Cell Discovery》发表题为“Structural Mechanism of TRPC3 Channel Activation by the Moonwalker Mutation”的研究论文。该研究依托短肽4F膜蛋白提取技术结合冷冻电镜单颗粒重构方法8，成功捕获“月行者”功能获得性突变T561A介导的TRPC3部分开放态构象，揭示了TRPC3通道激活的关键结构机制，填补了该领域长期存在的结构空白。
研究团队首先利用全细胞膜片钳技术表征了DAG类似物OAG介导的TRPC3电生理特征，发现野生型TRPC3电流呈现缓慢激活与渐进脱敏的动态过程，提示已报道的激动剂结合态结构大概率对应预开放态或脱敏态，无法真实反映通道激活机制。为区分两种构象状态，研究团队靶向突变DAG结合关键位点（E603A、V637A、K607A），构建得到三重突变体3M。功能实验证实，3M突变体完全丧失对OAG的响应能力，但仍可被合成激动剂GSK1702934A有效激活，证明该突变不会锁定通道于脱敏状态，其结构可代表无配体结合的静息关闭态。
为规避传统去垢剂提取带来的结构假象，研究团队采用4F短肽提取策略纯化3M突变体蛋白，通过冷冻电镜解析得到2.8 Å高分辨率的无激动剂结合TRPC3静息态结构。结构分析显示，经典DAG结合口袋L2位点无内源配体密度，与静息通道特征高度吻合；且该结构与4F纯化的DAG结合野生型TRPC3结构高度相似，证实3M突变体结构可代表TRPC3通道的静息关闭态构象（图1）。
图1 无激动剂结合的TRPC3 3M突变体关闭态结构
基于上述结果，研究团队推测野生型TRPC3在激动剂刺激下的开放概率较低，难以捕获瞬时开放构象。为此，研究团队以具有持续组成型活性的“月行者”突变体T561A为研究对象开展结构解析。电生理结果证实，T561A突变体可产生显著的组成型电流，电流强度显著高于激动剂激活的野生型通道，具备更强的本底开放活性。
研究团队通过相同纯化与冷冻电镜解析策略，获得了分辨率为2.93 Å的T561A突变体结构。相较于经典关闭态结构，该突变体的通道孔区发生显著扩张：T561位点突变破坏了S5-T561与S6-N652的分子间相互作用，诱导S6跨膜螺旋产生π凸起构象变化，促使S6螺旋下半段旋转并向外倾斜，最终驱动通道孔道扩张。值得注意的是，该孔道扩张幅度尚未达到完全离子通透状态，介于关闭态与完全开放态之间，为TRPC3通道激活过程中的部分中间开放构象（图2）。
图2 结合激动剂的TRPC3 T561A突变体部分开放态结构
此外，研究团队在T561A突变体结构解析中，还捕获了一类特殊C2对称构象（分辨率3.16 Å）。该构象胞内结构域（ICD）折叠模式无明显变化，但跨膜结构域（TMD）呈现不对称激活特征：对角两个亚基的L2位点结合DAG配体，稳定局部扩张构象；另外两个亚基的L2位点结构破坏、无DAG结合，导致通道选择性过滤器扭曲变形，整体处于非导通的失活状态（图3）。该结果证实，DAG在L2位点的特异性结合可稳定亚基界面，维持TRPC3通道的活化构象，是通道门控激活的关键分子基础。
图3 TRPC3 T561A突变体的C2对称性结构
综上，该研究成功解析了TRPC3关闭态、部分开放态及不对称C2对称中间态的高分辨率冷冻电镜结构，首次捕获TRPC3通道激活过程中的关键中间构象，阐明了“月行者”突变驱动通道构象转变、激活通道活性的分子机制。该工作填补了TRPC家族通道开放态结构信息的空白，完善了TRPC通道从静息关闭态到活化开放态的逐级门控模型，为深入理解TRPC家族功能调控机制提供了核心结构框架。
北京大学未来技术学院博士研究生臧佳和、前沿交叉学科研究院生物医学跨学科研究中心博士研究生谭咏梅为本文共同第一作者，北大-清华生命科学联合中心、北京大学未来技术学院陈雷研究员为论文通讯作者。研究工作得到课题组博士生陈逸坤、博士后郭文君的协助。石墨烯载网由北京大学化学与分子工程学院赵效乐博士、彭海琳教授合作制备；小分子BTDM由迪哲医药张小林博士馈赠。本研究负染电镜实验依托国家蛋白质科学基础设施北京基地北京大学分设施蛋白核心支撑平台完成，冷冻电镜数据采集依托北京大学冷冻电镜平台完成，得到李雪梅、郭振玺、秦昌东、王国鹏等工作人员的大力支持。数据处理工作依托北京大学CLS计算平台与未名超算平台完成。该研究获得科技部重点研发计划、国家自然科学基金、北大-清华生命科学联合中心等项目经费资助。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41421-026-00936-y
