蛋白质的亚细胞定位是其正确发挥功能的重要基础。除了翻译后转运，细胞还可通过空间特异的局部翻译（local protein translation），在特定亚细胞区域就地合成蛋白质，从而快速调节局部蛋白质组成。这一过程广泛参与细胞迁移、分化和突触可塑性等生命活动。
近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心邹鹏课题组联合陈鹏课题组以及中国医学科学院药物研究所罗惠鑫课题组，在PNAS在线发表了题为“OptoRibo-seq for spatiotemporally resolved mapping of the local protein translatome”的研究论文。该研究将遗传密码子扩展、光脱笼、邻近标记与核糖体谱学相结合，建立了光激活的核糖体邻近测序技术optoRibo-seq，可以在活细胞中对指定亚细胞区域的局部翻译组进行具有时空分辨率的系统分析。
现有局部翻译研究方法主要依赖成像或物理分离。成像方法虽然具有较高的空间分辨率，但检测通量通常有限，且往往需要事先获知目标RNA序列。将核糖体或亚细胞结构分离后进行测序，则容易带来样品损失和交叉污染，也难以适用于开放性亚细胞区域或不易分离的细胞结构。邻近标记能够在原位获取特定区域附近的分子信息，但如何精确控制核糖体标记的开始时间，以限制核糖体扩散带来的空间误差，仍是关键技术难题。
为解决这一问题，研究团队将大肠杆菌生物素连接酶BirA的关键催化残基Lys183替换为带有光保护基的非天然赖氨酸ONPK，构建了光激活型生物素连接酶photoBirA。在无光条件下，光保护基阻断酶的催化活性；经365 nm光照后，保护基脱落，photoBirA被快速激活并催化附近核糖体的生物素标记。通过将photoBirA定位至内质网膜，并在核糖体蛋白S25上引入可被标记的受体肽，研究团队将标记时间缩短至1 min。随后经单核糖体分离、亲和富集和核糖体保护片段测序，即可获得指定区域附近正在翻译的mRNA信息（图1）。
图1 optoRibo-seq通过光激活邻近标记实现亚细胞局部翻译组的时空分辨鉴定
研究团队首先将optoRibo-seq应用于人胚肾293T细胞的内质网膜区域。通过同时设置富集前样品和细胞质定位photoBirA作为对照，研究人员鉴定出299种内质网膜附近翻译的mRNA，其中272种（91.0%）编码已注释的分泌途径相关蛋白，表明该方法具有较高的空间特异性。对CANX、COPB2、HSP90AB1和SERPINB6等候选转录本的单分子荧光原位杂交验证进一步表明，这些mRNA与内质网膜的关联依赖于正在进行的核糖体翻译。其中，COPB2、HSP90AB1和SERPINB6缺乏典型信号肽，提示除经典的信号肽介导机制外，还可能存在未被充分认识的内质网局部翻译定位途径。
图2 optoRibo-seq高特异性鉴定内质网膜附近的局部翻译组
利用optoRibo-seq的1 min时间分辨率，研究团队进一步追踪了药物诱导内质网应激后0、0.5、2和8 h的局部翻译变化。分析显示，内质网膜附近的转录本呈现出五类不同的动态模式，涉及蛋白质折叠、定位转运和内质网稳态维持等未折叠蛋白反应相关过程。进一步整合全转录组、全局核糖体翻译组和内质网腔蛋白质组数据后，研究人员发现，内质网局部翻译构成了连接转录调控与蛋白质稳态的中间层次。例如，分子伴侣HSPA5 (BiP)的mRNA水平和内质网局部翻译均在应激后升高，但其在内质网腔中的蛋白质水平反而降低，反映了应激条件下蛋白质合成与降解的协同调节。
图3 optoRibo-seq揭示内质网应激过程中局部翻译组的动态变化
综上，optoRibo-seq通过光激活方式将核糖体邻近标记缩短至1 min，减少了对细胞状态的额外扰动，并提高了局部翻译组分析的空间精度。该方法为研究细胞器膜、开放性亚细胞区域乃至无膜细胞器附近的局部翻译提供了新的技术框架，也有望用于解析细胞在不同刺激和疾病状态下的亚细胞翻译调控。
北京大学化学与分子工程学院王睿轩博士和北京大学前沿交叉学科研究院王瑞祥博士为论文共同第一作者。北京大学、北大-清华生命科学联合中心邹鹏教授、陈鹏教授，中国医学科学院药物研究所罗惠鑫研究员为论文共同通讯作者。该工作得到了科技部、国家自然科学基金委员会和北京分子科学国家研究中心的资助。
原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2519235123
